• 將各種試劑移到室溫（18－25℃）平衡半小時，取一瓶20×洗液，加蒸餾水至600ml，混勻后備用。
   
• 將測HBsAg酶聯板從密封袋中取出，設一個空白對照孔，兩個陽性對照孔，兩個陰性對照孔。取陽性對照和陰性對照分別充分混勻后各50μl加入對照孔中，其余每個孔加待檢血清50μl，除空白孔以外，每孔加酶結合物50μl，充分混勻，用不干膠封片封蓋酶聯板，37℃溫育60分鐘。
   
• 棄去各孔內液體，洗板5次，每次靜置15－20秒，拍干。
   
• 每孔加顯色劑A50μl，顯色劑B50μl，輕輕振蕩后置37℃暗處顯色10分鐘，每孔加終止液50μl。
   
• 選擇酶標儀波長450nm，參考波長630nm，測定各孔A值。

Cutoff值＝2 .1× N （N為陰性對照平均A值，如小于0.05按0.05計算）

• 陽性對照平均A值應大于0.50。陰性對照平均A值應小于0.10，否則實驗不成立。
   
• 標本A值小于Cutoff值為陰性，大于等于Cutoff值為陽性。