• 將各種試劑移到室溫（18-25℃）平衡半小時，取一瓶20×洗液，加蒸餾水至600 ml，混勻后備用。
   
• 將酶聯板從密封袋中取出，設一個空白對照孔，兩個陽性對照孔，兩個陰性對照孔。取陽性對照和陰性對照分別充分混勻后各50μl加入對照孔中，其余每個孔加待檢血清5 0μl，除空白孔以外，每孔加酶結合物50μl ,充分混均，用不干膠片封蓋酶聯板 ，37℃溫育60分鐘。
   
• 棄去各孔內液體，洗板5次，每次靜置15－20秒，拍干。
   
• 每孔加顯色劑A 50μl ，顯色劑B 50μl ，輕輕振蕩后置37 ℃暗處顯色10分鐘，每孔加終止液50μl。
   

Cutoff值＝2 .1× N （N為陰性對照平均A值，如小于0.06按0.06計算）

• 陽性對照平均A值應大于0.50。陰性對照平均A值應小于0.10，否則實驗不成立。