肉桂酸-4-羥化酶（ Cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H)試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

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正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

C4H 又稱反式肉桂酸-4-單氧化酶，多存在于高等植物、酵母、菌類中，該酶催化肉桂酸羥化作用產生4-香豆酸鹽，是苯bing烷途徑中繼L-苯bing氨酸解氨酶之后的第二個關鍵酶。

測定原理：

C4H 催化肉桂酸和NADP 生成 4-香豆酸鹽和NADPH，在 340nm 下測定NADPH 生成速率，即可反映C4H 活性。

試劑的組成和配制：

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提取：

細菌或培養細胞：

先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：

按照組織質量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定

取試劑二一瓶，加入 10ml 試劑一充分溶解混勻，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；現配現用（配好后 24h 內用完）；

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本和 190μl 試劑二，混勻，立即記錄 340nm 處初始吸光值A1 和 5min 后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

C4H 活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產生 1 nmol 的NADPH 定義為一個酶活力單位。

C4H（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘產生 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

C4H（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=643×ΔA÷W

按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產生 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

C4H（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=1.286×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

用 96 孔板測定的計算公式如下

按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產生 1 nmol 的NADPH 定義為一個酶活力單位。

C4H（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘產生 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

C4H（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產生 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

C4H（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=2.572×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

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