磷脂酶D（ Phospholipases D，PLD ）試劑盒說明書

微量法 100T/96S

磷脂酶D試劑盒 脂肪酸系列

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

磷脂酶 D（EC3.1.4.4）即磷脂酰dan堿水解酶，是催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應的一類酶的總稱，廣泛存在于高等動植物和細菌等多種生物體中，具有參與細胞脂質代謝、信號傳導、生物膜形成的抗逆境脅等生理功能。

測定原理：

磷脂酶D 催化水解磷脂酰dan堿末端的磷脂酰二酯鍵生成磷脂酸和dan堿，dan堿在dan堿氧化酶催化作用下生成甜菜堿和過氧化氫，過氧化氫在過氧化氫酶的作用下將 4-氨基安ti比林和重蒸酚氧化成粉紅色物質，在 500nm 處有特征吸收峰。

組成：

試劑三：粉劑×1 支，-20℃避光保存。臨用前加 1ml 無水乙醇充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

自備儀器和用品：

天平、研缽、超速冷凍離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、恒溫水浴鍋、無水乙醇。

酶液提?。?/span>

組織：按照質量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1ml 提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 離心 30min，棄上清，取沉淀溶于 1ml 試劑一。

細胞：按照細胞數量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1ml提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后于 4℃，10000g離心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 離心 30min，棄上清，取沉淀溶于 1ml 試劑一。

血清：直接測定。

測定操作：

酶活計算公式：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰dan堿產生 1nmol dan堿所需的酶量為一個酶活力單位。

PLD 活性（nmol/min /mg prot）=

A測定管 ×C 標準÷Cpr÷T= 16.7× A測定管 ÷Cpr

按照樣本質量計算

A標準管

A標準管

酶活性定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰dan堿產生 1nmol dan堿所需的酶量為一個酶活力單位

PLD 活性（nmol/min /g 鮮重）=

A測定管 ×C 標準÷W÷T = 16.7× A測定管 ÷W 

按照細胞數量計算

A標準管

A標準管

酶活性定義：每 104 個細胞每分鐘水解磷脂酰dan堿產生 1nmol dan堿所需的酶量為一個酶活力單位。

PLD 活性（nmol/min /10⁴ cell）=

A測定管 ×C 標準÷細胞數量÷T = 16.7× A測定管 ÷細胞數量 

按照液體體積計算

A標準管

A標準管

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰dan堿產生 1nmol dan堿所需的酶量為一個酶活力單位。 

PLD 活性（nmol/min /ml）=

A測定管 ×C 標準÷T=16.7× A測定管

A標準管     A標準管

C 標準：標準品濃度，500nmol/ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質量，g/ml；T：反應時間，30min

用 96 孔板測定的計算公式如下

按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰dan堿產生 1nmol dan堿所需的酶量為一個酶活力單位。

 PLD 活性（nmol/min /mg prot）=

A測定管 ×C 標準÷Cpr÷T= 16.7× A測定管 ÷Cpr

按照樣本質量計算

A標準管

A標準管

酶活性定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰dan堿產生 1nmol dan堿所需的酶量為一個酶活力單位。

 PLD 活性（nmol/min /g 鮮重）=

A測定管 ×C 標準÷W÷T = 16.7× A測定管 ÷W

按照細胞數量計算

A標準管

A標準管

酶活性定義：每 10⁴ 個細胞每分鐘水解磷脂酰dan堿產生 1nmol dan堿所需的酶量為一個酶活力單位。

PLD 活性（nmol/min /10⁴ cell）=

A測定管 ×C 標準÷細胞數量÷T = 16.7× A測定管 ÷細胞數量按照液體體積計算

A標準管

A標準管

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰dan堿產生 1nmol dan堿所需的酶量為一個酶活力單位。

 PLD 活性（nmol/min /ml）=

A測定管 ×C 標準÷T=16.7× A測定管

A標準管     A標準管

C 標準：標準品濃度，500nmol/ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質量，g/ml；T：反應時間，30min

注意事項：

顯色完成后，若有沉淀，于 8000rpm，25℃離心 5min 后取上清測定。

吸光值不宜超過 1，否則用試劑一將酶液進行稀釋，并在計算公式中乘以稀釋倍數。

磷脂酶D試劑盒 脂肪酸系列