γ-谷an酰半胱an酸連接酶（glutamate cysteine ligase，GCL）說(shuō)明書

分光光度法 50 管/48 樣

γ-谷an酰半胱an酸連接酶 谷胱gan肽系列

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 對(duì) GCL 有反饋抑制作用。GCL 基因表達(dá)受多種因素調(diào)節(jié)，如氧化劑、抗氧化劑、生長(zhǎng)因子和炎癥因子等。GCL 活性高低對(duì)GSH 含量和GSH/GSSG 比值有重要影響。

測(cè)定原理：

在ATP 和Mg²⁺存在下，GCL 催化谷an酸和半胱an酸合成γ-谷an酰半胱an酸；同時(shí) ATP 去磷酸化產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷分子，通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷增加速率，即可計(jì)算出 GCL 活性。

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 14ml 蒸餾水充分震蕩溶解。 試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入蒸餾水 3.5 ml 充分震蕩溶解。

試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 30ml 蒸餾水，充分震蕩溶解后，緩緩加入 1.0 ml 濃硫酸（自備），邊加邊攪拌。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、冷凍離心機(jī)、水浴鍋、移液器、1ml 玻璃比色皿、濃硫酸和蒸餾水。

粗酶液提取：

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g， 4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

血清等液體：直接測(cè)定。

GCL 測(cè)定操作

分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 660 nm，蒸餾水調(diào)零。

空白管：取 1.5mlEp 管，依次加入試劑一 240 µl、試劑二 260µl、試劑三 60µl 和蒸餾水 120µl，混勻后 蓋緊，37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng) 15 min； 再加入試劑四 300µl，混勻后，25℃、8000g，離心 10 min，取上清 500µl，

加入試劑五 500µl，混勻后蓋緊，45℃水浴 10min，冷卻后測(cè)定 660 nm 處吸光值，記為 A 空白管。

測(cè)定管：取 1.5mlEp 管，依次加入試劑一 240 µl、試劑二 260µl、試劑三 60µl 和上清液 120µl，混勻后 蓋緊，37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng) 15 min； 再加入試劑四 300µl，混勻后，25℃、8000g，離心 10 min，取上清 500µl，

加入試劑五 500µl，混勻后蓋緊，45℃水浴 10min，冷卻后測(cè)定 660 nm 處吸光值，記為 A 測(cè)定管。

注意：空白管只需要測(cè)定一次。

GCL 活性計(jì)算公式：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.1427x，R2=0.9987

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 無(wú)機(jī)磷的GCL 酶活量為 1 個(gè)酶活單位。

GCL（μg/min /mg prot）=[（A 測(cè)定管-A 空白管）÷0.1427×V 反總]÷(Cpr×V 樣)÷T

=3.815×（A 測(cè)定管-A 空白管）÷Cpr

按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 無(wú)機(jī)磷的GCL 酶活量為為 1 個(gè)酶活單位。

GCL（μg/min /g 鮮重）= [（A 測(cè)定管-A 空白管）÷0.1427×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 3.815×（A 測(cè)定管-A 空白管）÷W

按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：37℃下，每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 無(wú)機(jī)磷的GCL 酶活量為 1 個(gè)酶活單位。

GCL（μg/min /104 cell）=[（A 測(cè)定管-A 空白管）÷ 0.1427×V 反總]÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

= 3.815×（A 測(cè)定管-A 空白管）÷細(xì)胞數(shù)量

按照液體體積計(jì)算

活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 無(wú)機(jī)磷的GCL 酶活量為 1 個(gè)酶活單位。

GCL（μg/min /ml）= [（A 測(cè)定管-A 空白管）÷ 0.1427×V 反總]÷V 樣÷T

=  3.815×（A 測(cè)定管-A 空白管）

0.1427：回歸方程系數(shù)；V 反總：反應(yīng)總體積（ml）980µl=0.980ml；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，120µl =0.12 ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間：15min。

注意事項(xiàng)：

樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反復(fù)凍融。

所有試劑配制完后，除表明 4℃保存外，請(qǐng)于 1 天內(nèi)用完。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程請(qǐng)帶手套，試劑三中有強(qiáng)腐蝕性物質(zhì)，注意不要濺到皮膚上或眼睛內(nèi)。

測(cè)定吸光值時(shí)請(qǐng)于水浴后 10～40 分鐘內(nèi)測(cè)完。

樣本測(cè)定前先取 1-2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如吸光值太高，應(yīng)先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，使得吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，哺乳動(dòng)物組織和血液一般稀釋 3～5 倍。

試劑三配制過(guò)程中，可能會(huì)產(chǎn)生黑色固體，其不影響結(jié)果，注意吸取時(shí)不要將黑色固體吸入。

細(xì)胞中GCL 活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在 300 萬(wàn)-500 萬(wàn)之間，細(xì)胞中GCL 的提取時(shí)可加試劑一（或生理鹽水）后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞；

γ-谷an酰半胱an酸連接酶 谷胱gan肽系列