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單層細胞系傳代培養指南2023/03/31

大多數細胞系和原代細胞培養物生長為單一厚度的細胞層（單層）或附著在玻璃或經過特殊處理的塑料基質上的薄片。為了保持培養物的健康和積極生長，通常需要定期對它們進行傳代培養。常見的傳代培養方法涉及通過使用蛋白水解酶（如胰蛋白酶或膠原酶）破壞細胞間和細胞與基質的連接。在細胞解離成主要由單細胞組成的懸浮液后，將它們稀釋并轉移到新的培養容器中。在那里它們可以重新附著并開始生長和分裂，經過一段時間的孵化后再次接近匯合。此時，它們可以再次進行傳代培養或用于實驗。以下指南描述了典型單層細胞培養的常規傳代和維護所涉

hTERT-成纖維細胞培養解決方案2023/03/29

hTERT成纖維細胞為永生化子宮內膜成纖維細胞(THESC)具有延長的壽命，并且在核型、形態和表型方面與原代親代細胞相似。在功能上，THESCs顯示激素治療后蛻膜化的生化終點。THESCs來源于從患有肌瘤的成年女性身上獲得的基質細胞。原代基質子宮內膜細胞通過用來自包裝細胞系pA317-hTERT的上清液感染而永生化，該細胞系表達hTERT和嘌呤霉素抗性基因。hTERT成纖維細胞培養方案如下：一、所需材料Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)/F12(Sigma,D2906)碳酸氫鈉IT

CRISPR-Cas9基因編輯實驗中的注意事項2023/03/29

在細胞上做基因研究的一般的過程就是：利用CRISPR-Cas9先做基因除(GeneKnockout)，獲得基因敲除細胞系純合細胞：然后分析相關的生物學表型；最后做為對照還需要將原敲除的基因回補會到原細胞系中，做為對照細胞進行實驗對比。而利用Cas9進行細胞敲除之后，細胞回補實驗室要注意哪些問題?特別需要考慮的技術原理是那些？如何規劃好實驗流程，下面我們就一步步的進一下細胞其因敲除和回補實驗的效率/價格/周期等。一、敲除細胞的方式一般都是純合基因敲除細胞，當然也可以選擇MixClone的方式；純合

細胞培養基pH值對細胞的影響2023/03/28

細胞培養基pH值對細胞的影響培養基是用來供給細胞營養，促使細胞增殖的，也是細胞賴以生長的環境。細胞培養實驗中用量最多的就是細胞培養基，雖然細胞培養試驗基本技術大同小異，但是每種細胞的培養條件卻相差甚遠。若偏離某種細胞所需的培養條件，則會導致細胞表達不同的表型。一、培養基體系主要成分及功能介紹1、葡萄糖：用于細胞能量代謝。2、CO?：細胞需要少量的二氧化碳來維持生長。在培養基中，溶解的CO?與碳酸氫鹽離子處于平衡狀態，許多培養基利用了這種CO?/碳酸氫鹽反應來緩沖培養基的pH值。CO?溶解在培養基

菌種保存常用的五種方法2023/03/27

各種微生物由于遺傳特性不同，因此適合采用的保藏方法也不一樣。一種良好的有效保藏方法，首先應能保持原菌種的優良性狀長期不變，同時還須考慮方法的通用性、操作的簡便性和設備的普及性。下面介紹幾種常用的菌種保藏方法：1.斜面低溫保藏法將菌種接種在適宜的斜面培養基上，待菌種生長完成后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時間（保藏期）再轉接至新的斜面培養基上，生長后繼續保藏，如此連續不斷。此法廣泛適用于細菌、放線菌、酵母菌和霉菌等大多數微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍干燥保藏的菌種。放線菌、霉菌和有芽孢的細

大腸桿菌分離用什么培養基2023/03/08

培養基作為細胞的“食物”，是細胞培養和發酵的基礎，大腸桿菌在不同的培養基中培養可能會表現出不同的性狀，而利用這些性狀的不同，可將部分菌種進行區分或分離，此外，根據目標菌種選擇合適的培養基可以低成本、穩定的高表達。大腸桿菌分離培養基常見的主要有以下幾種：大腸桿菌分離培養基：主要根據不同的大腸桿菌在培養基中的生產速度，代謝產物，對培養基中特定組分的需求利用情況不同等實現對不同種類的菌種進行分離或篩選。LB固體培養基：是一種主要組分為酵母提取物、胰化蛋白胨、NaCl瓊脂的非選擇性固體培養基，通常用于細

發酵工程培養基有哪些2023/03/08

發酵工程培養基主要使用發酵培養基：發酵培養基是指為了在生產中更加利于菌種代謝產物的生成而設計的培養基，這類培養基常見的主要有以下幾種：SOB（SuperOptimalBroth）培養基：是一種富營養培養基，其配方為：2%胰蛋白胨,0.5%酵母提取物,10mMNaCl,2.5mMKCl,10mMMgCl2,10mMMgSO4。與LB培養基相比，SOB培養基中含有兩倍多的蛋白胨，富含更多的氨基酸及多肽。此外，SOB培養基中含有鎂離子，鎂離子是高密度培養必須的離子。利用SOB培養基培養大腸桿菌在普通條

流式細胞技術介紹2023/03/02

流式細胞技術是一項廣為使用、基于激光的生物學技術，利用流式細胞儀對處于快速流動的熒光染色的細胞或生物顆粒進行多參數、快速的定量分析和分選，是當代主要的細胞定量分析技術之一。主要有以下幾個特點：1.只要樣本制成單個細胞或生物顆粒懸液均可以分析。2.測量速度快，每秒鐘可以測量數千個乃至數萬個細胞3.同時測量每個細胞的多參數特征。4.在進行細胞特征分析的同時可以把有特征細胞分離出來(分選技術)關于流式細胞儀流式細胞儀由三部分構成——1.液流系統，包括流動室和液流驅動系統；2.光學系統，包括激發光源和光

Transwell實驗的步驟2023/03/02

本文主要介紹4種Transwell實驗的實驗步驟，具體包括：Transwell腫瘤細胞遷移實驗、Transwell上皮細胞培養實驗、TranswellB16細胞的體外遷移實驗、Transwell內皮細胞HMEC-1遷移實驗。一、Transwell腫瘤細胞遷移實驗過程與Transwell侵襲實驗基本一致，不同的只是不需要鋪Matrigel。由于沒有基質膠的阻擋，細胞穿過膜的速度較侵襲實驗明顯加快，所以細胞量要更大。我做侵襲實驗的細胞密度是1×10°，而遷移實驗的密度是1×10°。另外，下層培養液的

重組蛋白表達技術要點2023/03/01

大腸桿菌（E.coli）表達重組蛋白的技術經過多年的發展，已經成為一個非常成熟表達系統。為了在大腸桿菌表達體系中獲得可溶以高表達產量的蛋白，一個優秀的表達策略是重要的。為了高效表達有活性蛋白，一般需考慮以下幾個因素：1.宿主體系的選擇細菌、酵母、哺乳動物細胞、絲狀真菌和單細胞藻類均可以作為表達宿主，每一種表達宿主都有各自的優缺點。如果需要表達的蛋白具有真核的翻譯后修飾（糖基化修飾），那么可以選擇酵母、哺乳動物細胞等，而大腸桿菌等原核表達體系則不適用。大腸桿菌作為表達外源蛋白廣泛體系，其優點主要包

凝膠電泳的染色方法2023/03/01

凝膠電泳是研究蛋白質性質的一種相對簡單、快速和高靈敏度的工具。它是分析化學、生物化學和分子生物學的主要工具。通過電泳分離蛋白質是基于這樣一個事實，即帶電分子將在施加電場時通過基質遷移。蛋白質電泳分離的基質是聚丙烯酰胺。用于形成聚丙烯酰胺的化學試劑是單體丙烯酰胺和N，N'-雙丙烯酰胺（雙-丙烯酰胺）。聚合丙烯酰胺和雙丙烯酰的方法是使用TEMED（四*基乙二胺）和過硫酸銨。聚丙烯酰胺凝膠內部的聚合形成了一個交聯的微孔網絡。這種孔隙網絡允許小蛋白質分子快速通過，同時減緩較大蛋白質的遷移，這導致蛋白質基

Vero細胞無血清懸浮培養技術驗證2023/03/01

大多數用于抗體生產的細胞主要基于動物細胞上的開發，如MRC-5人二倍體細胞、Vero猿猴腎上皮細胞、Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞和雞胚成纖維細胞。尤其是來自非洲綠猴腎臟的Vero細胞已被廣泛用于vaccine生產，因為它們被WHO機構證明沒有致癌潛力。許多vaccine，例如針對基孔肯雅熱、登革熱、日本腦炎、病毒性胃腸炎、脊髓灰質炎、狂犬病、羅斯河熱、嚴重急性呼吸系統綜合癥、天花、西尼羅河腦炎和流感的vaccine都是使用Vero細胞培養系統開發的。用于virusvaccine生產

一文了解細菌內毒素2023/02/28

內毒素(Endotoxin)是一種脂多糖(LPS)，來源于革蘭氏陰性細菌外膜，其細胞壁外膜的外部脂質成分由內毒素分子組成，細胞死亡或分解后被釋放出來。LPS具有三個結構，由菌體特異性多糖、非特異性核心多糖和脂質A三部分構成。內毒素單體分子量為10kDa左右，在不同成分水溶液中，可形成大分子聚集體，大的可超過1000kDa。類脂A是內毒素多種生物活性或毒性反應的主要基團。該基團沒有種屬特異性,所以各屬細菌的類脂A結構相似,其毒性反應相似，如發熱、血液流動力學改變、彌漫性血管內凝血,并導致休克等。O

細胞支原體污染的原因有哪些2023/02/28

細胞支原體污染的原因對于生物實驗器材細胞培養來說，如何預防細胞的支原體污染是每一個細胞培養者的都會考慮的問題，據統計，在細胞污染原因分析中有超過60%的細胞培養物污染都是由支原體所引起的。那么細胞支原體污染的原因有哪些呢？細胞支原體污染的原因主要包括：1.不良操作：如操作者未穿實驗服、未戴口罩、未熏蒸操作臺等，容易引起污染。支原體一般通過難以追蹤的各種來源進入細胞培養物。其中包括實驗室人員、血清、細胞培養基、水浴鍋、振蕩培養箱、生物反應器、細胞培養瓶等。人為污染是上述污染源中最大的污染源。污染物

細胞支原體污染怎么處理2023/02/28

用肉眼或光學顯微鏡檢測支原體比較困難，所以支原體檢測一般會通過PCR的檢測、DNA染色、熒光標記、瓊脂平板接種等方法來實現。在支原體檢測之前，細胞應連續培養至少兩周，以便有時間讓低水平的污染物生長。對于測試，在取樣前至少兩三天內不應更換培養基。一、培養法在瓊脂平板/肉湯上培養被認為是檢測支原體的“金標準”。在這種方法中，將細胞培養物的上清液添加到液體或半固體培養基（含有支原體生長所必需的營養物質）中。受感染的細胞培養物會在液體肉湯和瓊脂平板上生長。瓊脂平板上很容易看到支原體菌落。這種方法能夠檢測

細胞培養試劑選購指南2023/02/28

細胞生物學研究、創新藥開發等領域經常會進行細胞體外培養，但是很多實驗員不知道該怎么選購細胞、細胞培養基、細胞培養試劑，本節小編帶你初步了解一下細胞系的選擇技巧、購買細胞培養基應考慮的因素。一、細胞培養的環境條件細胞的體外培養需要為細胞創造良好的細胞的存活和增殖環境，這樣的環境條件包括培養溫度、濕度和CO2水平、營養成分、酸堿度、滲透壓等。下表為大多數哺乳動物細胞的細胞培養的適宜條件。酸堿度7.0–7.4滲透壓280–320mmol/千克二氧化碳_5–10%溫度35–37°C二、細胞系購買時應考慮

貼壁細胞傳代培養的基本步驟2023/02/28

我們知道開始培養的細胞不能無限期地生長，因為受限區域內的細胞數量不斷增加，營養物質也會被消耗，從而導致有毒的代謝產物增加，另外根據實驗或生產需要，也要對細胞進行擴大培養。通過去除培養基并將細胞轉移到新鮮的生長培養基和基質中，細胞獲得了新鮮的營養并去除了有毒代謝物，從而可以長期維持培養。這個過程就屬于傳代培養，傳代培養的細胞密度會低于原始培養物中的細胞密度。當接種細胞后，細胞生長會經過滯后期、對數期，穩定期和凋亡期。在凋亡期，細胞會因缺乏營養或培養條件不當而死亡。貼壁細胞傳代培養步驟如下：一、細胞

生物安全柜內HEPA 和 ULPA 過濾器的區別2023/02/27

過濾器是生物安全柜的重要組成部分。了解過濾器的工作原理、維護級別以及過濾器需要多久更換一次，這些都是購買生物安全柜時需要考慮的因素。那么生物安全柜中的HEPA和ULPA過濾器有什么區別呢？生物安全柜中使用的過濾器，一般為高效微?？諝?HEPA)過濾器和超低滲透(ULPA)過濾器，HEPA和ULPA過濾器有什么區別呢？HEPA和ULPA過濾器的結構及其工作原理從結構和化學角度來說，HEPA和ULPA過濾器非常相似。這些過濾器用于生物安全柜，其中氣流（由電機驅動）攜帶有害氣體和顆粒物。兩種類型的過濾

國產PCR儀購買時的注意事項2023/02/21

國產PCR儀購買時的注意事項PCR儀作為分子生物學相關實驗的常規儀器，每年都有數千臺的選購量，這兩年一批國產PCR儀正在興起。購買國產PCR儀需要考慮以下因素1樣本管的種類現在主要有0.2ml和0.5ml兩種，使用0.5mlPCR管的人員已經很少了，一是0.5mlPCR專用的薄壁管很少見，二是如果想要較大體積的PCR產物，可以通過多分幾個0.2mlPCR管來實現。除非經常需要較大體積的PCR產物，否則可以不必考慮0.5ml型的PCR儀。2樣本容量種類很多，0.2ml的有96孔和48孔，0.5ml

瓊脂糖凝膠電泳時注意事項2023/02/21

瓊脂糖凝膠電泳分子生物學常用的實驗方法，那么在凝膠電泳過程中需要注意哪些事項呢？一、切膠時的注意事項1.盡量保證電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺子清理干凈，刀片也要洗凈，確保切下的沒有外源dna污染。2.為了減少膠的體積，可以用相對比較薄的膠來做，只要夠點樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。3.關于防護，戴一般有機玻璃眼罩就足夠了，戴上防護面具也以保護眼睛，如果戴樹脂眼鏡就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者對于膠有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用點marker和帶刻度的尺子一起